論文一個花生新SSR標(biāo)記

所屬分類：農(nóng)業(yè)論文閱讀次時間：2015-03-20 10:32

本文摘要：摘要：本研究利用SCoT12引物對8個不同花生品種擴增產(chǎn)物中的一個長度多態(tài)性片段SCoT12-800進行克隆和測序分析，該序列登錄號為KM200036。結(jié)果表明，該片段多態(tài)性是由于其含有一段TC簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat， SSR)，根據(jù)該片段序列，利用Primer

　　摘要：本研究利用SCoT12引物對8個不同花生品種擴增產(chǎn)物中的一個長度多態(tài)性片段SCoT12-800進行克隆和測序分析，該序列登錄號為KM200036。結(jié)果表明，該片段多態(tài)性是由于其含有一段TC簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat， SSR)，根據(jù)該片段序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計出一對適合SSR分子標(biāo)記檢測的引物，命名為SCoT12-SSR，該引物的擴增產(chǎn)物大小為164～178 bp，在花生栽培種中可檢測到5個等位變異，可用于花生的遺傳多樣性、品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建等研究。

　　關(guān)鍵詞：花生;分子標(biāo)記;SCoT;SSR　農(nóng)業(yè)核心論文

　　花生(Arachis hypogaea L.)又名落花生，是我國重要的經(jīng)濟作物和油料作物之一。栽培花生是包含來自于不同野生品種A和B兩個基因組的異源四倍體作物[1]。研究表明，單一雜交多倍化以及在育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本，使得品種間的遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄，基因組高度保守，遺傳多樣性降低[2]。因此，了解栽培花生品種間的遺傳多樣性，開發(fā)有效的遺傳多樣性標(biāo)記對于花生育種以及種質(zhì)鑒定都具有重大意義。

　　SSR(Simple Sequence Repeat)又稱為微衛(wèi)星DNA，是指由2～6個核苷酸為基本單位多次串聯(lián)重復(fù)所構(gòu)成的一段DNA序列。SSR標(biāo)記技術(shù)與目前常用的如RFLP、RAPD、STS、SCAR、SPAR、AFLP等標(biāo)記技術(shù)相比，具有分布均勻、簡單快速、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好以及多態(tài)性豐富等優(yōu)點，因此在水稻[3]、玉米[4]、小麥[5]等作物研究中得到了廣泛應(yīng)用。花生SSR分子標(biāo)記的開發(fā)相對緩慢，雖然目前已經(jīng)公布的花生SSR分子標(biāo)記數(shù)達到了15 518，但只有13.5%～14.5%的分子標(biāo)記在花生栽培種中具有多態(tài)性[6，7]，很難滿足現(xiàn)今的科研需求。

　　目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT)分子標(biāo)記是由Collard和Mackill[8]開發(fā)的一種目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)，該標(biāo)記依據(jù)植物基因中ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計單引物對基因組進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。SCoT分子標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生的標(biāo)記大部分是顯性標(biāo)記(引物結(jié)合位點的點突變)，但也會產(chǎn)生像RAPD標(biāo)記技術(shù)一樣的由于插入-缺失突變引起的長度多態(tài)性共顯性標(biāo)記，其產(chǎn)物片段大小在200～2 000 bp之間。SCoT分子標(biāo)記作為一種新型的分子標(biāo)記具有操作簡便、可在各物種間通用、能有效產(chǎn)生與性狀連鎖的標(biāo)記等特點。目前，該標(biāo)記技術(shù)已在水稻、馬鈴薯[9]等作物中成功應(yīng)用，在花生中也有報道[10，11]。但由于該技術(shù)采用單引物擴增，使其存在擴增條帶過多，特別是一些共顯性插入-缺失片段由于差異不明顯而造成結(jié)果不易分析等缺點。

　　本研究利用已公布的SCoT分子標(biāo)記對8個不同的花生品種進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其中一個引物SCoT12擴增產(chǎn)物中的一個片段存在長度多態(tài)性差異。測序結(jié)果表明該片段包含一段TC重復(fù)，并利用該序列成功開發(fā)出了一個具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　8個供試品種，分別為950527、花育22號、DF12、開農(nóng)176、開17-15、York-1、Q13-2-1、Q13-21-1。所用供試材料均種植于山東省花生研究所試驗基地，并在苗期取健康植株上的無病蟲害幼嫩葉片，液氮速凍后于-70℃保存。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 DNA提取及PCR反應(yīng) 基因組DNA提取采用小量CTAB法，并做了相應(yīng)改良。SCoT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照熊發(fā)前等[12]報道的方法進行優(yōu)化。優(yōu)化后的PCR體系總體積為10 μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技(北京)有限公司]3.75 μL、0.5 μmol/L引物、50 ng基因組DNA。PCR程序為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán);72℃最后延伸5 min。SSR-PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán);72℃最后延伸5 min。SCoT-PCR使用SCoT12引物[11]，SSR-PCR使用根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)的SCoT12-SSR引物(引物序列見表1)。